La heterogeneidad genética del difuso …

La heterogeneidad genética del difuso ...

Abstracto

Palabras clave: secuenciación de próxima generación, la genética del cáncer, cáncer de la heterogeneidad

resultados

Secuenciación del Genoma de un linfoma descubre el espectro de la somática La variación en DLBCL.

tejido de biopsia linfoma y la médula ósea no afectado se obtuvieron de la misma paciente. El uso de la plataforma Illumina, se generaron en total de 171 Gb de 100 pb secuencias de gama sincronizado desde el tumor y se correspondía con genomas normales correspondientes a un promedio de cobertura por secuenciación-base de 37 veces y 20 veces, respectivamente.

Se identificaron 23,214 secuencia de las alteraciones somáticas que se producen a lo largo del genoma linfoma, que se resumen en la Fig. 1 UN y segundo y Apéndice SI. Tabla S1.

Los resultados de la secuenciación de un genoma linfoma. (UN ) Diagrama de Circos (36) que resume las variantes genéticas somáticas adquiridas en un genoma DLBCL. El anillo exterior representa el cromosoma ideograma orientada hacia la derecha, PTER-qter. El siguiente anillo indica la copia .

La secuenciación del exoma Define el espectro de la región de codificación de las mutaciones en el DLBCL.

Para identificar los genes mutados de forma recurrente en DLBCLs, se obtuvo un total de 73 casos de muestras humanas primarias. Dividimos los casos humanos primarios en un conjunto de descubrimiento (norte = 34) y un conjunto prevalencia (norte = 39). Para cada uno de el descubrimiento establece casos de DLBCLs primarios, también secuenciado emparejado tejido normal. Además, hemos secuenciado los exomas de 21 líneas celulares DLBCL que son ampliamente utilizados para modelar la enfermedad.

La validación de la variante genética de identificación.

En primer lugar, se realizó de alto rendimiento, PCR multiplex en microgotas (Raindance tecnologías; ref 18) y la secuenciación a más de 100 veces la cobertura de 179 genes (Apéndice SI. S5 Tabla) en ocho casos. Más de 99% de las variantes eran idénticos (Fig. 2segundo ; Apéndice SI. S6 Tabla). La cobertura de 100 veces no dio lugar a un aumento sustancial en el descubrimiento de variante, confirmando nuestras estimaciones que nuestra cobertura de la exoma era adecuado para la identificación de variantes en la mayoría de los casos.

Los patrones de variación y Exoma identificación de genes cancerígenos DLBCL.

Nuestros métodos para la identificación de los genes del cáncer candidatos DLBCL se detallan en el Apéndice SI . Hemos desarrollado un modelo estadístico para comparar las características de los genes mutados somáticamente en nuestro conjunto de descubrimiento de 34 pares de tumor normal a los genes del cáncer previamente validados. Hemos modelado varias variables incluyendo la frecuencia de variación nonsynonymous en el gen, la frecuencia de mutación somática, el tamaño de gen, la tasa de variación nonsynonymous en controles sanos, y el efecto previsto de la alteración genética en la proteína codificada. genes del cáncer de DLBCL fueron identificados como los que tenían una distribución de puntuación más similares a los de los genes del cáncer previamente validados (PAG 10 6).

Se identificaron 322 genes candidatos cáncer LBDCG como recurrentemente mutados somáticamente en DLBCL (conjunto de datos S3). La mayoría de los 52 genes relacionados con el cáncer conocidos y los 270 genes restantes no se han identificado previamente como que tiene un papel en los linfomas. Entre estos 322 genes del cáncer de DLBCL, se identificaron un total de 1.418 variantes en estos casos (Fig. 2GRAMO ; Conjunto de datos S4). No había una mayor proporción de cada categoría de mutaciones no sinónimas incluyendo missense (66,4%), sin sentido (2,4%), y del marco de lectura (2.5%), y menos mutaciones sinónimas (28,7%) en estos genes en comparación con los patrones observados en la totalidad exoma.

Una vez más, se observó un predominio de las transiciones (PAG 10 6. 2 de ensayo; Higo. 2MARIDO ). En general, los tamaños de las inserciones y deleciones en estas DLBCLs conservado marcos de lectura, con picos observados en la inserción / deleción tamaños de tres, seis, nueve, y así sucesivamente (Fig. 2yo ). Sin embargo, en los 322 genes del cáncer de DLBCL, se observó una disminución significativa de tamaños indel que eran múltiplos de tres (Fig. 2J ; PAG 0,01, 2 pruebas).

Identificación de codificación de la proteína de secuencia variación en DLBCL.

Los patrones mutacionales de estos 322 genes del cáncer de DLBCL en los 73 linfomas primarios, así como las líneas 21 celulares, se representan en la Fig. 3UN . La mediana del número de DLBCL alteraciones de los genes del cáncer por paciente fue de 16 (media, 17).

Los patrones de mutaciones en exonic DLBCLs. (UN ) Mapa de calor indica el patrón de mutaciones de los genes del cáncer 322 DLBCL en 73 DLBCLs primarias y 21 líneas de células DLBCL. Cada columna representa una línea de paciente o de células y cada fila representa un gen del cáncer de DLBCL. .

Higo. 3segundo muestra la frecuencia de los genes del cáncer de DLBCL, que siguieron una distribución clásica cola larga. Nuestros datos identifican una serie de genes relacionados con el cáncer conocidos en DLBCL que han sido reportados previamente e incluyen TP53 (23), MYD88 (24), PIM1 (25), CARD11 (13), y BCL6 (25). Nuestros datos también implican un número de genes relacionados con el cáncer que no fueron previamente vinculado a DLBCL, incluyendo PIK3R1. ARID1A. mTOR. y Idh1. Estos datos indican que el espectro de mutaciones y genes implicados en linfomas, y potencialmente otros tipos de cáncer, puede ser mucho más grande que se ha apreciado anteriormente.

Para entender mejor las posibles diferencias relacionadas con el subgrupo-en los patrones observados de mutaciones DLBCL, se realizó un perfil de expresión génica mediante microarrays de Affymetrix para distinguir DLBCLs similares a células B activadas (norte = 29) y los centros germinales B DLBCLs similares a células (norte = 35). Hemos encontrado 12 genes (Fig. 3do ) Con una frecuencia de al menos 10% en cada subgrupo que se mutaron diferencialmente entre los dos grupos (PAG 0,05, prueba exacta de Fisher). Los genes que fueron mutados con mayor frecuencia en DLBCLs ABC incluyen MYD88, KLHL14, CD79b, y SIGLEC10, mientras GNA13. BCL2 y EZH2 fueron más frecuentemente mutado en GCB DLBCL. De éstos, también encontramos GNA13 y EZH2 a mutar recurrente en el linfoma de Burkitt (26), otro tumor derivado de las células del centro germinal B.

La categorización funcional de los genes mutados en Recurrentemente DLBCL.

Determinación de genes enriquecido con mutaciones relacionadas con el AICDA.

Asimismo, examinó el papel potencial de AICDA (AID) en la adquisición de estas mutaciones somáticas en los casos de DLBCL. Para los 322 genes del cáncer de DLBCL, se determinó el número de mutaciones adquiridas en donde la secuencia de referencia fue de C, y de ellos, la fracción que cayó en motivos WRCY (y el complemento inverso), que se asocian con la actividad AICDA (29).

Se realizó una prueba exacta de Fisher para determinar el significado de enriquecimiento para las mutaciones en los motivos WRCY en comparación con la tasa de fondo. Encontramos enriquecimiento significativo (PAG 0,05) de motivos WRCY en PIM1, BTG1 y CD79b, lo que sugiere que AICDA es un importante contribuyente a las alteraciones somáticas en estos genes.

alteraciones de genes en PIM1, BTG1 y CD79A no se han descrito en la mayoría de los tumores sólidos, lo que sugiere alteraciones relacionadas con el AICDA son un mecanismo de linfoma específico, similar a su papel se describe en la biología de células B.

PIK3CD Se identifica como un oncogén, y PI3 quinasa La inhibición es un enfoque terapéutico potencial en DLBCL.

vía de la PI3 quinasa en DLBCLs. (UN ) Secuenciación profunda lee identificar una mutación somática en PIK3CD en un tumor DLBCL. La secuenciación del genoma lee a juego perfectamente se muestran en gris. Las dos muestras difieren sólo en un único nucleótido que es G en el tumor, .

Hemos encontrado mutaciones en dos oncogenes conocidos adicionales en la vía de la PI3 quinasa, PIK3R1 y mTOR. apuntando a la desregulación de la vía de la PI3 quinasa oncogénica como un mecanismo importante en DLBCLs. Otros miembros clave de la vía con funciones oncogénicas conocidas, incluyendo PTEN, FOXO3, y GSK3, no se mutaron en nuestros casos. Similares a los patrones observados previamente en PIK3CA (30), las mutaciones en PIK3CD. PIK3R1. y mTOR aparecerá a extenderse a través de múltiples localizaciones del gen (Fig. 4do ) En lugar de agrupar en un solo punto de acceso.

Hemos modelado la PIK3CD estructura de la proteína basada en la de su paralog PIK3CG, que ha sido determinado a través de la cristalografía (31). La mutación identificada se encuentra en el dominio catalítico en la estructura predicha de la proteína (Fig. 4re ). Overexpressed el WT y el mutante PIK3CD construcciones en la línea celular de linfoma FL5.12 que está bien caracterizado para su señalización PI3 quinasa dependiente de IL3 (32). En estas células, la retirada de IL3 se asocia con una disminución medible en la señalización de la quinasa PI3 y la disminución de AKT fosforila, que está directamente aguas abajo de PI3 quinasa y proporciona señales proliferativas. En las células que expresan la forma WT de PIK3CD. se encontró que la retirada de IL3 se asoció con una disminución medible en fosforilada AKT S473 (Fig. 4mi ). No hubo disminución mensurable en la AKT fosforilada en células que expresan la forma mutante de PIK3CD. lo que sugiere que la mutación tenía un efecto activador (Fig. 4mi ). Estas observaciones se confirmaron en tres réplicas experimentales, todos los cuales mostraron que la retirada IL3 se asoció con una significativa baja regulación en AKT fosforilada en células que expresan WT PIK3CD (PAG = 0,04), pero no en células que expresan el mutante PIK3CD (PAG = 0,44; Higo. 4F ). experimentos de ELISA también demostraron patrones similares de activación de la quinasa PI3 en células que expresan el mutante PIK3CD (Apéndice SI. Higo. S8).

Entre PIK3CD. PIK3R1. y mTOR. solamente mTOR se encontró que se mutado en múltiples líneas celulares (además de casos de pacientes). Se investigaron los efectos de un inhibidor de molécula pequeña de la PI3 quinasa, BKM120 (Novartis), sobre la viabilidad de las 21 líneas celulares DLBCL (Fig. 4GRAMO ). Las tres líneas celulares con mTOR mutaciones tuvieron, en promedio, una de cinco veces mayor sensibilidad a la inhibición de quinasa PI3 de esos 18 líneas de células que no albergan estas mutaciones (PAG = 0,005, Wilcoxon rank test). Estos resultados sugieren fuertemente que la presencia de mutaciones en mTOR está asociada con la sensibilidad a la inhibición de quinasa PI3.

Comparación con otros estudios genéticos revela la heterogeneidad genética llamativo de DLBCL.

Superposiciones en los genes descubiertos en varios estudios sobre el cáncer. Los diagramas de Venn muestran la comparación de las mutaciones genéticas de los cuatro estudios DLBCL. El número entre paréntesis indica el número de genes identificados en cada estudio. Las listas de genes fueron los siguientes: .

Aunque los genes que no se superpongan entre los estudios podrían significar algunos falsos positivos, nuestro análisis indica que se identificaron una serie de oncogenes validados y genes supresores tumorales en un solo estudio. Los ejemplos incluyen NOTCH1 (34), CD74 (34), BCL10, IRF4, MALT1, TET2 (7), BCR, ETV6 (33), PIK3R1. mTOR. KIT, PDGFRA, y ARID1A (Nuestro estudio). El número de genes de cáncer identificados pareció aumentar linealmente como una función del tamaño del estudio, lo que indica, además, que las diferencias entre los estudios individuales surgen de la heterogeneidad genética inherente de los tumores DLBCL, un efecto que también se observó en otros tipos de cáncer (Apéndice SI. Higo. S7).

Discusión

Una observación central de nuestro estudio es la heterogeneidad genética sorprendente que subyace a un cáncer relativamente común. Como hemos demostrado, hay un solapamiento relativamente baja entre cuatro estudios diferentes que exploran la genética de DLBCL. A pesar de las diferencias en la metodología, la diversidad de las poblaciones de pacientes, y el número de pacientes que podrían contribuir a esta baja solapamiento, nuestros datos indican que el principal impulsor de la escasa superposición es la heterogeneidad genética inherente de la enfermedad. En consonancia con esta heterogeneidad observada, se demuestra que el número de variantes raras y mutaciones somáticas aumenta linealmente con el aumento del número de casos, lo que sugiere que la continuación de la secuenciación de los tumores implicará nuevas variantes y nuevos genes relacionados con el cáncer.

perfiles de expresión génica ha revelado previamente aspectos de la heterogeneidad de la enfermedad, particularmente con respecto a la célula de origen de DLBCLs (2). Nuestros datos indican que las mutaciones recurrentes en 12 genes fueron enriquecidos con claridad entre ABC y DLBCLs GCB DLBCLs. Por lo tanto, los dos subgrupos DLBCL comparten los patrones de mutaciones de muchos más genes, sugiriendo que los mecanismos compartidos subyacen a su biología. La heterogeneidad genética sorprendente observada en la enfermedad en su conjunto también se recapitula en estos subgrupos.

El reconocimiento de las mutaciones recurrentes en el gen de codificación de las regiones en que la enfermedad es un primer paso importante hacia la comprensión de su biología y potenciales posibilidades terapéuticas. Las mutaciones somáticas previamente se han observado en varios genes en la vía de NF-B, incluyendo TNFAIP3 (A20) y CARD11 (35). Ambos de estos genes se encontró que tenían casos somáticas en nuestro estudio y al menos uno de los estudios publicados recientemente DLBCL (7. 8. 33). genes modificadoras de histonas, como MLL2 y MEF2B. se encontró que ser mutado con frecuencia en DLBCL (32% y 11,4%, respectivamente) (7). Aunque MLL2 no se incluyó en nuestra biblioteca de captura exoma, que fue diseñado usando Build 36 del genoma humano, también hemos observado mutaciones somáticas en MEF2B y CREBBP, un gen de acetiltransferasa se informó anteriormente (34). MLL3, que forma complejos con MLL2, fue el gen más frecuentemente mutado en nuestros casos. Nuestros datos también implican mutaciones relacionadas con el AICDA como un mecanismo importante mutaciones genéticas subyacentes en los genes PIM1, BTG1 y CD79b. Estas observaciones ponen de relieve los diversos mecanismos biológicos que subyacen a la diversidad genética observada.

La heterogeneidad genética de DLBCLs y otros tipos de cáncer implica que no importa lo que recurrentemente alterada de genes o vía se considera, sólo una minoría de los pacientes son propensos a ser afectados. Por ese subgrupo de pacientes cuyo tumor alberga un número cada vez mayor de lesiones genéticas reconocidas que pueden ser objetivo terapéutico, el reconocimiento de dichas alteraciones pueden hacer una diferencia crucial en su tratamiento. Una serie de mutaciones genéticas que hemos identificado, incluidos los de PIK3CD. KIT y PDGFRA, sugieren posibilidades terapéuticas en los pacientes afectados. Nuestros datos sugieren que tendrán que ser combinado con ensayos cuidadosamente seleccionados tales enfoques terapéuticos específicos en pacientes de estas lesiones tumorales genéticos para comprender mejor su papel en la respuesta a las terapias dirigidas. Nuestros datos también tienen importantes implicaciones sobre cómo se modela tipos de cáncer y la necesidad de determinar si el ratón existentes y otros modelos recapitulan la enfermedad primaria. Por lo tanto, nuestro estudio arroja luz sobre la heterogeneidad genética de los linfomas, así como los cánceres en general, y subraya la necesidad de enfoques individualizados para tratar a los pacientes.

métodos

Métodos detallados se proporcionan en el Apéndice SI . secuenciación completa del genoma y la secuenciación del exoma se llevaron a cabo en la plataforma Illumina. Lecturas de secuenciación fueron asignadas al genoma de referencia, y se identificaron variantes, cotejada y anotada.

Material suplementario

referencias

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Se proporcionan artículos de Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América aquí por cortesía de Academia Nacional de Ciencias

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